14 de agosto de 2012

Troubleshooting: Seu RNA é uma goma...e agora?

 Leitor do RNAse Free (por e-mail):

Quando vou fazer a extração de RNA de músculo de anfíbios há a formação de uma "goma" que não se desfaz e isso acaba prejudicando o resultado final. Já tentei a extração por kit e tradicional, mas nada funciona. Você já teve uma experiência como essa?




Sim, eu já tive uma experiência como esta! Ao extrair RNA de músculo de ostra por extração orgânica/ácida (com o famoso reagente "rosinha" que não cito o nome para não fazer propaganda de graça! rs), eu tive exatamente este problema. O pellet obtido era um material gelatinoso e insolúvel, que não dissolvia em água por nada.

A resposta para este problema eu encontrei no manual do reagente de extração de RNA. A presença de material insolúvel pode acontecer com tecidos com alto teor de proteínas, gorduras, polissacarídeos ou material extracelular. O músculo é um exemplo destes tecidos "problemáticos", pois tem alto teor de polissacarídeos e proteínas, como o colágeno, que acabam formando o material insolúvel obtido no final da extração.

A solução indicada no manual é bem simples e funcionou com as minhas amostras de músculo de ostra. Após homogeneizar o tecido no reagente de extração, deve-se centrifugar o homogenato obtido (12000xg, 4ºC, durante 10 minutos). Após esta centrifugação, o material insolúvel em questão estará precipitado. Deve-se, então, transferir o sobrenadante para um novo tubo e descartar este precipitado. A partir daí, basta dar continuidade ao protocolo recomendado.

Na época, isso foi o suficiente para resolver o problema. Mas além desta centrifugação extra, uma purificação com cloreto de lítio pode ajudar também! Eu sou "fã" do cloreto de lítio, como já falei aqui, por que ele precipita RNA, mas não precipita DNA, proteínas e polissacarídeos. E, portanto, remove estes contaminantes da amostra de RNA. Quem quiser saber mais sobre o cloreto de lítio, pode dar uma olhada neste link: "The Use of LiCl Precipitation for RNA Purification".



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