14 de agosto de 2012

Troubleshooting: Seu RNA é uma goma...e agora?

 Leitor do RNAse Free (por e-mail):

Quando vou fazer a extração de RNA de músculo de anfíbios há a formação de uma "goma" que não se desfaz e isso acaba prejudicando o resultado final. Já tentei a extração por kit e tradicional, mas nada funciona. Você já teve uma experiência como essa?




Sim, eu já tive uma experiência como esta! Ao extrair RNA de músculo de ostra por extração orgânica/ácida (com o famoso reagente "rosinha" que não cito o nome para não fazer propaganda de graça! rs), eu tive exatamente este problema. O pellet obtido era um material gelatinoso e insolúvel, que não dissolvia em água por nada.

A resposta para este problema eu encontrei no manual do reagente de extração de RNA. A presença de material insolúvel pode acontecer com tecidos com alto teor de proteínas, gorduras, polissacarídeos ou material extracelular. O músculo é um exemplo destes tecidos "problemáticos", pois tem alto teor de polissacarídeos e proteínas, como o colágeno, que acabam formando o material insolúvel obtido no final da extração.

A solução indicada no manual é bem simples e funcionou com as minhas amostras de músculo de ostra. Após homogeneizar o tecido no reagente de extração, deve-se centrifugar o homogenato obtido (12000xg, 4ºC, durante 10 minutos). Após esta centrifugação, o material insolúvel em questão estará precipitado. Deve-se, então, transferir o sobrenadante para um novo tubo e descartar este precipitado. A partir daí, basta dar continuidade ao protocolo recomendado.

Na época, isso foi o suficiente para resolver o problema. Mas além desta centrifugação extra, uma purificação com cloreto de lítio pode ajudar também! Eu sou "fã" do cloreto de lítio, como já falei aqui, por que ele precipita RNA, mas não precipita DNA, proteínas e polissacarídeos. E, portanto, remove estes contaminantes da amostra de RNA. Quem quiser saber mais sobre o cloreto de lítio, pode dar uma olhada neste link: "The Use of LiCl Precipitation for RNA Purification".



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Envie suas perguntas na forma de comentários ou por e-mail (blog.rnase.free @ gmail. com) e suas dúvidas poderão dar origem a um post na sessão "Troubleshooting" do RNAse Free.


25 de julho de 2012

10th International Congress on Cell Biology

Hoje, estive no 10th International Congress on Cell Biology, este ano realizado aqui no Rio de Janeiro. Como parte do mini-curso "Cellular and Molecular Tools in Invertebrate Models", falei um pouco sobre PCR quantitativo com algumas considerações para quem trabalha com invertebrados. Quem quiser dar uma olhada, os slides do mini-curso estão disponíveis aqui, logo abaixo.






15 de julho de 2012

O marisco de 400 anos – como um pequeno molusco engana o tempo e vive através dos séculos.

“Posso ouvir o vento passar,
assistir à onda bater,
mas o estrago que faz
a vida é curta pra ver...”
(O vento, Marcelo Camelo)

Para alguns animais, a vida é ainda mais curta do que para outros. Quase tão curta quanto o breve intervalo de tempo entre marés. As efémeras são pequenos insetos que, como o nome sugere, vivem por pouco tempo, cerca de um dia. A efémera adulta vive algumas horas, não se alimenta e investe sua energia na reprodução, para deixar filhotes que também viverão somente o dia seguinte. Mas alguns animais tem uma estratégia de vida diferente e investem a maior parte da sua energia no crescimento e manutenção corporal. Pensando neste extremo oposto, tente adivinhar que animal vive por mais tempo e você provavelmente pensará nos elefantes, que vivem em média 70 anos, ou talvez nas tartarugas, que podem atingir 150 anos. Mas se engana quem pensa que eles batem o recorde. O recordista é um pequeno marisco, parente das ostras e mexilhões, chamado Arctica islandica. Ele vive enterrado no fundo do frio oceano Atlântico norte e pode viver mais de 400 incríveis anos.

Continue a ler no blog do Bioma

25 de março de 2012

SHORT TIPS - Quando as bandas do gel sorriem...

...não é um bom sinal! 


Depois de correr uma reação de PCR em um gel agarose, você já se deparou com uma banda tão torta que chega a parecer um sorriso? 



Apesar do DNA ser o código da vida, não, ele não está criando vida própria. Alguns pequenos erros explicam isso:

  1. O gel não ficou complemente submerso no tampão de corrida.
  2. O volume de amostra aplicado no gel foi muito pequeno (deve ocupar pelo menos 1/3 do volume do poço).
  3. Condições de corrida impróprias. A pressa pode nos tentar a aumentar a voltagem. Mas existe um limite de voltagem que depende do tamanho do gel e da cuba. Não use mais que 5-8 V* por cm (de distância entre os eletrodos), ou suas bandas irão literalmente rir da sua cara. *Procure descobrir a voltagem recomendada pelo fabricante do padrão de tamanho que você usa.
  4. Bolhas ou partículas no gel ou nos poços também podem atrapalhar.

Se você tem tido outros problemas com eletroforese de DNA, como bandas pouco intensas, rastros, padrões de tamanho atípicos ou DNA que não sai do poço, dê uma olhada neste "troubleshooting". Ele explica muita coisa!



18 de março de 2012

Será o fim de Sanger?



A genética avançou grandes passos no século XX. Foi somente na década de 1920 que foi demonstrado que o DNA é a molécula portadora da informação genética e, menos de 100 anos depois, é impressionante o quanto descobrimos sobre como esta informação é codificada, traduzida, transmitida e regulada.

Como já falei por aqui, um marco importante na história da genética foi a invenção do sequenciamento de DNA em 1977 – um método que levou o nome do seu inventor, Sanger. Mas o reinado absoluto de Sanger começou a ruir na década de 2000, quando surgiu a próxima geração de sequenciadores (Next Generation Sequencing, NGS), baseados em novos e diferentes princípios químicos, como pirosequenciamento, Solid, Illumina e, mais recentemente, Ion Torrent. A grande diferença está na velocidade e capacidade de sequenciamento, muito superiores a tecnologia anterior. O genoma humano que levou 13 anos para ser concluído com o método de Sanger, agora pode ser sequenciado em apenas um dia. Um salto e tanto, não? E quando o céu parecia ser o limite, uma 3ª geração de sequenciadores já começa a surgir no horizonte, com a promissora tecnologia dos nanoporos.

Parece óbvio que chegou a hora de o método de Sanger sair de linha e pendurar suas chuteiras. Os novos sequenciadores irão eventualmente liderar projetos grandes de sequenciamento de genomas e transcriptomas inteiros. É uma questão de dinheiro. O custo por base sequenciada é bem menor nos novos sequenciadores, mas em compensação eles são menos flexíveis quanto à quantidade de bases sequenciadas, ou você sequencia muitos pares de base de uma vez, ou você não sequencia nada. E por isso, acredito que o Sanger irá cada vez mais assumir um papel secundário, sendo utilizado para preencher gaps em genomas ou em projetos pequenos, como para confirmar construções ou a identidade de produtos de PCR.

Mas, por enquanto, o sequenciamento de Sanger ainda é considerado o “padrão ouro” em acurácia. E para realmente se consolidarem no mercado, o custo para a implementação e manutenção das plataformas de NGS precisa se tornar mais acessível e estas novas tecnologias ainda precisam de otimização e, principalmente, mais validação. O tamanho das sequências produzidas precisa aumentar, o que já vem acontecendo de maneira consistente, e também é preciso desenvolver algoritmos mais precisos para inferir a qualidade das leituras (o que varia conforme a técnica), e para montagem e manipulação da grande quantidade de dados produzida.

Chegamos ao ponto de produzir muito, mas muito mais dados do que somos capazes de processar e, principalmente, explorar. E, mais do que produzir sequenciadores mais velozes, agora é mais importante melhorarmos e validarmos os já existentes e, principalmente, pensarmos em como vamos manipular, interpretar e aplicar todos estes dados para transformá-los em informações úteis.

10 de março de 2012

SHORT TIPS - Quando enzimas de restrição cortam onde não devem



Laboratório de biologia molecular que se preze tem pelo menos meia dúzia de enzimas de restrição no freezer. Elas cortam o DNA, não em pontos aleatórios, mas em sequências específicas, os sítios de restrição. Um grande número destas enzimas já foi identificado e está disponível comercialmente. Cada uma delas reconhece e corta um sítio de restrição diferente. E é justamente por isso que elas são tão úteis. Não importa qual seja a sua aplicação - cortar um plasmídio e/ou gene para clonagem ou a análise do padrão de fragmentos de um genoma – a especificidade destas enzimas é sempre essencial para o sucesso do experimento.

Mas, como nem tudo é perfeito, em algumas condições estas enzimas podem cortar o DNA onde não devem, ou seja, em sequências diferentes do seu sítio de restrição. O nome deste fenômeno é “atividade estrela” (star activity) e acontece quando a reação de digestão do DNA não segue as condições consideradas ótimas para o funcionamento da enzima. Em geral, você estará seguro se seguir o protocolo do fabricante, mas veja abaixo alguns cuidados para evitar este problema, principalmente, ao modificar o volume de reação.

Quantidade de enzima por reação.
Não deve ultrapassar 10% do volume final da reação. A enzima vem em uma solução que contem 50% de glicerol. E mais de 5% de glicerol na reação irá causar atividade estrela. Também é importante respeitar a quantidade de enzima (unidades) por quantidade (ug) de DNA recomendada pelo fabricante.

Tampão.
Use sempre o tampão recomendado, na diluição indicada. Em geral, cada enzima tem um tampão ótimo. E, a não ser que tenham composições iguais, o tampão de uma, não pode ser usado com outras enzimas.

Tempo de digestão.
Eu sei o quanto as incubações “overnight” (de um dia para o outro) são legais e práticas. Mas, por mais que o fabricante diga que a digestão pode levar de 2 a 18 horas, use sempre o tempo mínimo, ou algo mais próximo dele. Digestão longa demais pode resultar na perda de especificidade da enzima.

Contaminação da amostra.
Como já falei antes por aqui e aqui, RNA contaminado é sempre um problema para reações enzimáticas. E com DNA não é diferente. Tenha certeza que sua amostra está pura, sem vestígios de sais, álcool ou outros solventes orgânicos.

Referência:

24 de fevereiro de 2012

Cola de Mexilhão



Quando você pensa sobre mexilhões, qual a primeira imagem que vem na sua mente? Provavelmente, algum prato a base de frutos do mar, que inclua os suculentos mariscos. Com certeza, quase ninguém imagina que a utilidade dos mexilhões pode ir muito além da cozinha e chegar até centros cirúrgicos, consultórios odontológicos e na indústria naval. Isso por que estes animais tem algo que pode ser muito útil para todas estas áreas.


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