19 de novembro de 2011

Troubleshooting: o que fazer quando o RNA está com a razão 260nm/230nm baixa?

Leitor RNAse Free (por e-mail): "Meu RNA está com muito contaminante, pois a razão 260/230 está bem baixa. Tenho que obrigatoriamente fazer extração por Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, então gostaria de saber se você tem alguma dica de como melhorar a pureza do meu RNA e que não interfira nos microRNAs. Vi que você escreveu sobre um protocolo com cloreto de lítio, você chegou a testar? Funciona?”




Identificando o problema
A contaminação indicada pela razão 260/230 baixa pode ser causada por diferentes compostos. No caso do método do Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, podem ser traços destes compostos ou ainda de sal, álcool ou, dependendo do tecido de origem, polissacarídeos. Eu recomendo você ler suas amostras também a 270 nm e calcular a razão 260/270 que indica contaminação por fenol. Esta razão deve estar em torno de 1.2. Se estiver muito abaixo deste valor, então sua amostra está realmente contaminada com traços do reagente de extração (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio). Mas se não, é mais provável que sejam traços de sal, etanol ou polissacarídeos.


O que fazer?
Para evitar que sua amostra seja contaminada com o reagente de extração de RNA (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio), é preciso tomar muito cuidado na etapa de remoção do sobrenandante (a fase aquosa que contém o RNA e que se forma após a primeira etapa de centrifugação). É um pouco de prática. É preciso remover o sobrenandante sem se aproximar muito da interface. No entanto, é impossível remover todo o sobrenadante sem trazer um pouco de DNA genômico (a nuvem branca entre as fases orgânica e aquosa) e da fase orgânica (rosa, que fica na parte inferior do tubo). Então, nesta hora, é melhor perder um pouco de sobrenadante, mas ter certeza que todo o sobrenandante recolhido não está contaminado. 


Se você quiser tentar salvar suas amostras já contaminadas sugiro que você faça uma nova purificação com Fenol/Clorofórmio seguida de precipitação com etanol/acetato de sódio e lavagem com etanol 70%. Esta nova purificação com solvente orgânico irá remover os traços de fenol/clorofórmio. Mas, novamente, é preciso muito cuidado na remoção do sobrenadante.
Mas se suas amostras estiverem contaminadas com sal ou álcool basta fazer uma nova precipitação (adicionando 2.5 volumes de etanol absoluto e 1/10 volumes de acetato de sódio 3M) e em seguida lavando o pellet com etanol 70%. A maioria das pessoas tem pavor de vortexar os tubos nesta etapa de lavagem. Mas a não ser que seu pellet não seja visível, você deve vortexar gentilmente para lavar bem o pellet e remover o excesso de sais. Eu costumo fazer esta etapa pelo menos duas vezes.


Purificação com cloreto de lítio
Eu sempre faço a purificação com cloreto de lítio em todas as minhas amostras de RNA extraídas com Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio. Funciona mesmo. O RNA fica bem mais limpo e é essencial para amostras que possam estar contaminadas com polissacarídeos, como aquelas extraídas a partir de tecido muscular, por exemplo. No entanto, o cloreto de lítio não precipita de forma eficiente microRNAs. Então, não recomendo que você inclua esta etapa nas suas extrações, já que você tem interesse nesse tipo de RNA.


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Envie suas perguntas na forma de comentários ou por e-mail (blog.rnase.free @ gmail. com) e suas dúvidas poderão dar origem a um post na sessão "Troubleshooting" do RNAse Free.

4 comentários:

Andrea disse...

Olá Juliana! Como vai? Gosto muito do seu blog. Estou sempre lendo os seus posts para sanar minhas dúvidas. Estou trabalhando com a expressão de um microRNA em uma especie de planta. Estou dando início aos trabalhos porém estou tendo problemas com polissacarídes em minhas amostras. O pellet tem ficado branco, aspecto viscoso e muito difícil de ressuspender. Voce acha que uma nova reextracao com fenol-cloroformio resolveria? Ou eu poderia utilizar o próprio Trizol nesse processo seguido de nova precipitação? Agradeço desde já!! Abraco, Andréa

Juliana Americo disse...

Oi Andrea!

Se você está usando Trizol para extrair o seu RNA, existe uma etapa opcional, indicada para tecidos ricos em polissacarídeos, proteínas e/ou gorduras:

1.Following homogenization, centrifuge
your sample at 12,000 × g for 10 minutes
at 4°C.
Note: The resulting pellet contains
ECM, polysaccharides, and high
molecular weight DNA, while the
supernatant contains the RNA. In high
fat content samples, a layer of fat
collects above the supernatant.
2. Remove and discard the fatty layer. [se houver uma, no caso de tecidos com gorduras]
3. Transfer the cleared supernatant to a
new tube [no caso de polissacarídeos, um pellet gelatinoso é formado, descarte-o e prossiga com o sobrenandante].
Protocolo completo aqui neste link: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf

Para salvar as amostras já extraídas, eu usaria a precipitação com cloreto de lítio, no entanto, o cloreto de lítio NÃO precipita pequenos RNAs, apenas RNAs > 200 nt, então, não seria indicado no seu caso, infelizmente. Talvez você poderia fazer um teste usando o próprio trizol, mas incluindo a etapa adicional sobre a qual falei inicialmente e, depois, seguindo o protocolo convencional. Faz sentido, mas eu nunca testei.

Boa sorte! :)

Abraços,

Juliana

Anônimo disse...

Se polissacarídeos (é amostra de árvore frutífera?) é o problema, fenol-clorofórmio ou Trizol pode não ser útil. Estes métodos são bons para remover compostos polifenólicos (também alguns outros componentes de planta), mas não são métodos eficazes pois polissacarídeos serão dissolvidos na fase mais líquida. Assim, quando se precipitar o RNA (incluindo RNA total miRNA), a partir da fase líquida, os polissacarídeos vão se co-precipitar com RNA, o que torna muito difícil ter uma boa qualidade de RNA. Eu costumava trabalhar com pêra, maçã, ameixa, pêssego, etc .. para a purificação de RNA e tive problema semelhante que essas amostras que contém alto nível de amido (polissacarídeos) com o fenol convencional ou métodos de purificação Trizol RNA. Duas coisas úteis que aprendi: Primeiro você precisa de um bom tampão RNA lise para quebrar os polissacarídeos. Segundo, um kit baseado coluna de centrifugação foi muito mais eficiente para remover polissacarídeos. Existem muitas empresas que fornecem amostras grátis de kit de purificação de RNA de amostras de planta. Você pode pedi-los para sua validação (nada a perder!).

Maria José disse...

Estou passando um aperto com meus RNAs e encontrei o seu blog. Muito legal por sinal! Vou fazer um breve desabafo: eu extrai RNA de tecido usando o trizol seguido do RNAeasy Kit (Qiagen). Vc deve ter percebido que eu nao adicionei o cloformio (porque eu nunca tinha trabalhado com RNA e a pessoa que estava me ensinando esqueceu dessa parte fundamental). Quando fiz o nanodrop e o gel, pude perceber que as amostras estao altamente contaminadas com DNA e proteinas. Como foi um experimento longo e oneroso, queria, de algum jeito, conseguir limpar esse RNA para fazer o qPCR.

Voce teria alguma sugestao para me ajudar? Obrigada