5 de março de 2011

Troubleshooting - Sequenciamento de DNA


 Uma leitora, após várias tentativas de sequenciar alguns clones, me pediu algumas dicas sobre sequenciamento de DNA. Na minha experiência, as principais causas de problemas durante o sequenciamento estão relacionadas ao preparo das amostras. Vamos à discussão sobre algumas delas! O texto não é longo, mas se estiver com pressa, não deixe de olhar o checklist no final do post.
Purificação do DNA.
É muito importante utilizar um bom método de purificação de DNA, de preferência, um kit comercial adequado para esta aplicação. Purificar DNA com métodos “caseiros” pode funcionar, mas dificilmente vai remover todos os contaminantes que podem inibir a reação de sequenciamento. Uma maneira de verificar a presença de contaminantes em sua amostra purificada é determinar o seu espectro de absorbância. Como já falei por aqui, a razão entre as absorbâncias a 260/280 é um bom indicador de contaminação por proteínas, enquanto que a razão 260/230 é um bom indicador de contaminação por outros compostos orgânicos e por sais.
Para evitar contaminantes inibidores, deve-se usar água ultrapura para ressuspender ou eluir o DNA. Caso esteja usando um kit, verifique se o tampão de eluição não contém EDTA ou sais. O EDTA é um quelante de íons bivalentes e inibe a reação de sequenciamento ao sequestrar os íons de magnésio essenciais para a atividade da DNA polimerase.
Quantificação de DNA
Adicionar muito DNA pode inibir a reação, alterar a migração das amostras nos capilares ou mesmo bloqueá-los! Por mais que pareça pouco, adicione a quantidade de DNA recomendada pelos técnicos ou pelo kit de sequenciamento, que pode variar de acordo com o tipo de amostra (produto de PCR, DNA plasmidial, etc). No entanto, colocar menos DNA que o recomendado também não é bom e resultará em sinais de fluorescência muito baixos.
Para não errar por excesso e nem por escassez, é importante quantificar de forma precisa as amostras que serão sequenciadas. Se você tem poucas amostras, é fortemente recomendado a quantificação por eletroforese em gel de agarose. Aplique uma alíquota da sua amostra e em paralelo um fragmento de concentração conhecida e de tamanho próximo ao da sua amostra. Após a corrida, compare a intensidade das bandas por meio de um software de análise imagens como o ImageJ e estime a concentração da sua amostra com base na comparação entre as intensidades dos dois fragmentos. A maioria dos padrões de DNA indica em seus datasheets as quantidades relativas de pelo menos alguns dos seus fragmentos. Além de permitir a quantificação mais precisa do fragmento a ser sequenciado, através da eletroforese também é possível verificar se sua amostra não está degradada e detectar fragmentos contaminantes, como bandas de PCR não específicas, dímeros de primers, DNA genômico ou RNA, que condenariam o sequenciamento ao gerarem cromatogramas com picos sobrepostos.
Quantidade e integridade do primer
O primer é tão importante quanto a amostra. Adicione sempre a quantidade recomendada. Pouco primer também resultará em sinais de fluorescência baixos. A quantificação e a qualidade de purificação do primer dependem do fabricante, mas certifique-se que suas diluições estão corretas. Um dos possíveis problemas é o primer estar degradado. Para evitar a degradação guarde-os conforme o recomendado (-20ºC) e prepare alíquotas diluídas para reduzir os ciclos de descongelamento e congelamento da solução estoque. Nunca descongele seus primers aquecendo-os ou a temperatura ambiente, mas sempre em gelo. Em caso de suspeita de degradação, teste-os em um PCR com uma amostra controle, bem purificada.  
Especificidade do Primer
Se você está sequenciando um gene clonado em um vetor plasmidial, provavelmente, irá usar um primer já padronizado para este vetor. Se você desenhou primers específicos para o seu alvo, certifique-se que eles sejam específicos - que não se liguem em outras regiões do seu DNA template - e que não formem estruturas secundárias, como já discutido aqui.
Formação de estruturas secundárias no DNA alvo.
Isso pode ocorrer principalmente quando o DNA alvo é rico em GC. A formação dessas estruturas impede a incorporação de nucleotídeos e bloqueia o prosseguimento da reação de sequenciamento.

Recomendo a leitura deste site para aqueles que quiserem se aprofundar mais. Nele, são apontadas as causas para falhas específicas no sequenciamento.
Se tiver perguntes ou quiser sugerir a inclusão de mais algum ponto  esta lista, deixe um comentário.