23 de novembro de 2011

RNAse Free "nas nuvens"



Se você é dependente da internet como eu, todos os dias também deve se deparar com a avalanche de informações que vem assim que damos o primeiro click: notícias do dia (e dos últimos segundos), e-mails, redes sociais, mais e-mails, blogs, revistas, livros, artigos,...É difícil selecionar o que é importante, sem gastar algum tempo com o que não é. A "nuvem de palavras" (“word/tag cloud", em inglês) é uma forma bem interessante de lidar com isso e obter uma boa perspectiva geral do conteúdo de um texto ou site. Funciona assim: a nuvem é formada pelas palavras mais frequentes do texto/site analisado, sendo a relevância de cada palavra indicada pelas cores e tamanho da fonte. Uma idéia simples, mas muito útil. Do tipo que nos faz pensar: “Por que eu não pensei nisso antes?”. Vejam abaixo, a nuvem de palavras do RNAse Free que eu fiz no Wordle (clique na imagem para ampliá-la).




RNA, DNA, sequenciamento, degradação, primer? Quem conhece blog deve concordar que diz muito sobre ele. É claro que a nuvem de palavras não substitui a leitura completa do texto, mas ajuda a encontrar a informação que você procura mais rapidamente...além de ser visualmente mais atrativo do que dezenas e dezenas de páginas indevassadas. Todos os sites (e blogs) deveriam ter uma. Eu vou já providenciar uma nuvem de tags com hiperlinks para o RNAse Free...mas todos ainda terão que continuar lendo os posts (que acharem relevantes) até o fim! :)

19 de novembro de 2011

Troubleshooting: o que fazer quando o RNA está com a razão 260nm/230nm baixa?

Leitor RNAse Free (por e-mail): "Meu RNA está com muito contaminante, pois a razão 260/230 está bem baixa. Tenho que obrigatoriamente fazer extração por Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, então gostaria de saber se você tem alguma dica de como melhorar a pureza do meu RNA e que não interfira nos microRNAs. Vi que você escreveu sobre um protocolo com cloreto de lítio, você chegou a testar? Funciona?”




Identificando o problema
A contaminação indicada pela razão 260/230 baixa pode ser causada por diferentes compostos. No caso do método do Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio, podem ser traços destes compostos ou ainda de sal, álcool ou, dependendo do tecido de origem, polissacarídeos. Eu recomendo você ler suas amostras também a 270 nm e calcular a razão 260/270 que indica contaminação por fenol. Esta razão deve estar em torno de 1.2. Se estiver muito abaixo deste valor, então sua amostra está realmente contaminada com traços do reagente de extração (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio). Mas se não, é mais provável que sejam traços de sal, etanol ou polissacarídeos.


O que fazer?
Para evitar que sua amostra seja contaminada com o reagente de extração de RNA (Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio), é preciso tomar muito cuidado na etapa de remoção do sobrenandante (a fase aquosa que contém o RNA e que se forma após a primeira etapa de centrifugação). É um pouco de prática. É preciso remover o sobrenandante sem se aproximar muito da interface. No entanto, é impossível remover todo o sobrenadante sem trazer um pouco de DNA genômico (a nuvem branca entre as fases orgânica e aquosa) e da fase orgânica (rosa, que fica na parte inferior do tubo). Então, nesta hora, é melhor perder um pouco de sobrenadante, mas ter certeza que todo o sobrenandante recolhido não está contaminado. 


Se você quiser tentar salvar suas amostras já contaminadas sugiro que você faça uma nova purificação com Fenol/Clorofórmio seguida de precipitação com etanol/acetato de sódio e lavagem com etanol 70%. Esta nova purificação com solvente orgânico irá remover os traços de fenol/clorofórmio. Mas, novamente, é preciso muito cuidado na remoção do sobrenadante.
Mas se suas amostras estiverem contaminadas com sal ou álcool basta fazer uma nova precipitação (adicionando 2.5 volumes de etanol absoluto e 1/10 volumes de acetato de sódio 3M) e em seguida lavando o pellet com etanol 70%. A maioria das pessoas tem pavor de vortexar os tubos nesta etapa de lavagem. Mas a não ser que seu pellet não seja visível, você deve vortexar gentilmente para lavar bem o pellet e remover o excesso de sais. Eu costumo fazer esta etapa pelo menos duas vezes.


Purificação com cloreto de lítio
Eu sempre faço a purificação com cloreto de lítio em todas as minhas amostras de RNA extraídas com Tiocianato de Guanidina/Fenol/Clorofórmio. Funciona mesmo. O RNA fica bem mais limpo e é essencial para amostras que possam estar contaminadas com polissacarídeos, como aquelas extraídas a partir de tecido muscular, por exemplo. No entanto, o cloreto de lítio não precipita de forma eficiente microRNAs. Então, não recomendo que você inclua esta etapa nas suas extrações, já que você tem interesse nesse tipo de RNA.


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Envie suas perguntas na forma de comentários ou por e-mail (blog.rnase.free @ gmail. com) e suas dúvidas poderão dar origem a um post na sessão "Troubleshooting" do RNAse Free.

18 de agosto de 2011

Controle de qualidade de RNA - Opções “low cost”

Todo cuidado é pouco quando trabalhamos com RNA. Para se manipular este “ácido nucléico de uma fita só”, absolutamente tudo deve ser livre de RNAses, enzimas que estão por toda parte e que podem rapidamente degradar o nosso RNA de cada dia. Além disso, temperaturas elevadas e exposição à UV também podem degradar o RNA. Mas isso já foi discutido por aqui, logo no começo do blog (não é a toa que o nome deste blog é RNAse Free).
Se você quer isolar e identificar mRNAs completos ou quantificar níveis de mRNA por PCR quantitativa ou microarranjo de DNA, é essencial se certificar que a sua amostra de RNA esteja pura e íntegra. Um RNA contaminado pode afetar a eficiência de retrotranscrição. Um RNA ainda que apenas parcialmente degradado pode diminuir a precisão dos resultados ou mesmo arruinar o experimento.
É fácil reconhecer um RNA totalmente degradado através de eletroforese em gel de agarose (veja a amostra 1 na figura abaixo). Mas uma degradação parcial é mais difícil de identificar. Os RNAs 2 e 3 estão ambos íntegros? Com certeza? O RNA 3 parece íntegro para mim, mas o 2 me deixa na dúvida (Observação: o esperado para estas amostras é uma única banda de RNA ribossomal, pois trata-se de RNA total extraído de espécies de moluscos bivalves. Amostras de RNA obtidas de vertebrados, no entanto, devem exibir duas bandas de RNA ribossomal).

Como já falei por aqui, o Bioanalyzer é um equipamento que permite uma avaliação mais precisa da integridade do RNA através de eletroforese capilar. Mas ainda é bem caro e pouco comum nos laboratórios.
Então, como identificar uma degradação parcial de forma, digamos...mais econômica? Eis o “método” que chamo de “Bioanalyzer low cost”. Você deve fracionar sua amostra de RNA por eletroforese em gel de agarose em condições desnaturantes. Eu sigo o protocolo descrito por Masek et al (2005), pois é bem prático e efetivo. No entanto, no lugar do brometo de etídio, se possível, seria melhor usar algum corante mais sensível, como o SYBR Green II que detecta até 500 pg de RNA. A dica está em fazer uma análise densitométrica da imagem do gel usando um software de acesso livre como o Image J. Transformando o perfil eletroforético do RNA em um gráfico de densitometria é mais fácil identificar indícios de degradação parcial do RNA (ao menos para os meus olhos, que não são de águia).
É importante não aplicar RNA em excesso no gel e usar a mesma quantidade para todas as amostras. Usando brometo de etídio, eu não aplico mais de 800 ng (é possível usar ainda menos). Se você usar outro corante, mais sensível, use menos RNA ainda. RNA demais no gel pode resultar em um “rastro” que não necessariamente significa degradação.



E agora, olhando os gráficos ficou mais fácil decidir se amostra 2 tem sinais de degradação? O RNA íntegro (3), com uma única banda, resulta em um gráfico em formato de sino estreito, quanto maior a “barriga” do sino, maior o indício de degradação. Na amostra 1, esta “barriga” é bem grande, indicando seu alto grau de degradação. Na amostra 2, além do pico principal, observamos dois picos menores, indicando uma possível degradação parcial. 
Independente de analisar o perfil densitométrico da imagem ou não, é importante que a eletroforese tenha sido feita em condições desnaturantes, para evitar a formação de estruturas secundárias que no gel apareceriam como múltiplas bandas que poderiam ser confundidas com degradação. 
É claro que este "método" não é preciso e sensível como o bioanalyzer. É apenas uma dica para tornar a visualização de degradação mais clara e fácil!
Outro método acessível (baseado em PCR) para avaliar a integridade de amostras de RNA de forma mais acurada é a chamada razão 5’/3’. Mas este fica para o próximo post. Até lá! 

5 de março de 2011

Troubleshooting - Sequenciamento de DNA


 Uma leitora, após várias tentativas de sequenciar alguns clones, me pediu algumas dicas sobre sequenciamento de DNA. Na minha experiência, as principais causas de problemas durante o sequenciamento estão relacionadas ao preparo das amostras. Vamos à discussão sobre algumas delas! O texto não é longo, mas se estiver com pressa, não deixe de olhar o checklist no final do post.
Purificação do DNA.
É muito importante utilizar um bom método de purificação de DNA, de preferência, um kit comercial adequado para esta aplicação. Purificar DNA com métodos “caseiros” pode funcionar, mas dificilmente vai remover todos os contaminantes que podem inibir a reação de sequenciamento. Uma maneira de verificar a presença de contaminantes em sua amostra purificada é determinar o seu espectro de absorbância. Como já falei por aqui, a razão entre as absorbâncias a 260/280 é um bom indicador de contaminação por proteínas, enquanto que a razão 260/230 é um bom indicador de contaminação por outros compostos orgânicos e por sais.
Para evitar contaminantes inibidores, deve-se usar água ultrapura para ressuspender ou eluir o DNA. Caso esteja usando um kit, verifique se o tampão de eluição não contém EDTA ou sais. O EDTA é um quelante de íons bivalentes e inibe a reação de sequenciamento ao sequestrar os íons de magnésio essenciais para a atividade da DNA polimerase.
Quantificação de DNA
Adicionar muito DNA pode inibir a reação, alterar a migração das amostras nos capilares ou mesmo bloqueá-los! Por mais que pareça pouco, adicione a quantidade de DNA recomendada pelos técnicos ou pelo kit de sequenciamento, que pode variar de acordo com o tipo de amostra (produto de PCR, DNA plasmidial, etc). No entanto, colocar menos DNA que o recomendado também não é bom e resultará em sinais de fluorescência muito baixos.
Para não errar por excesso e nem por escassez, é importante quantificar de forma precisa as amostras que serão sequenciadas. Se você tem poucas amostras, é fortemente recomendado a quantificação por eletroforese em gel de agarose. Aplique uma alíquota da sua amostra e em paralelo um fragmento de concentração conhecida e de tamanho próximo ao da sua amostra. Após a corrida, compare a intensidade das bandas por meio de um software de análise imagens como o ImageJ e estime a concentração da sua amostra com base na comparação entre as intensidades dos dois fragmentos. A maioria dos padrões de DNA indica em seus datasheets as quantidades relativas de pelo menos alguns dos seus fragmentos. Além de permitir a quantificação mais precisa do fragmento a ser sequenciado, através da eletroforese também é possível verificar se sua amostra não está degradada e detectar fragmentos contaminantes, como bandas de PCR não específicas, dímeros de primers, DNA genômico ou RNA, que condenariam o sequenciamento ao gerarem cromatogramas com picos sobrepostos.
Quantidade e integridade do primer
O primer é tão importante quanto a amostra. Adicione sempre a quantidade recomendada. Pouco primer também resultará em sinais de fluorescência baixos. A quantificação e a qualidade de purificação do primer dependem do fabricante, mas certifique-se que suas diluições estão corretas. Um dos possíveis problemas é o primer estar degradado. Para evitar a degradação guarde-os conforme o recomendado (-20ºC) e prepare alíquotas diluídas para reduzir os ciclos de descongelamento e congelamento da solução estoque. Nunca descongele seus primers aquecendo-os ou a temperatura ambiente, mas sempre em gelo. Em caso de suspeita de degradação, teste-os em um PCR com uma amostra controle, bem purificada.  
Especificidade do Primer
Se você está sequenciando um gene clonado em um vetor plasmidial, provavelmente, irá usar um primer já padronizado para este vetor. Se você desenhou primers específicos para o seu alvo, certifique-se que eles sejam específicos - que não se liguem em outras regiões do seu DNA template - e que não formem estruturas secundárias, como já discutido aqui.
Formação de estruturas secundárias no DNA alvo.
Isso pode ocorrer principalmente quando o DNA alvo é rico em GC. A formação dessas estruturas impede a incorporação de nucleotídeos e bloqueia o prosseguimento da reação de sequenciamento.

Recomendo a leitura deste site para aqueles que quiserem se aprofundar mais. Nele, são apontadas as causas para falhas específicas no sequenciamento.
Se tiver perguntes ou quiser sugerir a inclusão de mais algum ponto  esta lista, deixe um comentário.

25 de fevereiro de 2011

Troubleshooting



Depois de muito tempo longe do blog, resolvi tirar a poeira inaugurando uma nova categoria de posts no RNAsefree: Troubleshooting.

Como recebo muitas perguntas por e-mail, frequentemente repetidas, achei que seria mais proveitoso publicar as perguntas e respostas no blog, pois a dúvida de um pode ser a mesma de muitos.

O nome "troubleshooting" faz referência ao tópico de solução de problemas que vem em todos os manuais de kits e reagentes de biologia molecular (e que todos deveriam ler, na maior parte das vezes são realmente úteis).

Deixem suas perguntas na forma de comentários ou escrevam para o e-mail: blog.rnase.free @ gmail. com

E suas dúvidas poderão dar origem a um post no blog!

Em breve, publicarei o primeiro post troubleshooting sobre preparo de amostras para sequenciamento de DNA pelo método de Sanger.

OBS.: Os nomes dos autores das perguntas assim como informações sobre seus projetos não serão publicados.