16 de abril de 2009

Clonagem III: e as bibliotecas?


Esclarecidos alguns pontos no post anterior...a dificuldade da clonagem de bibliotecas de cDNA é que se tem em mãos uma mistura complexa com seqüências de diferentes tamanhos...o que torna impossível saber ao certo a razão molar e calcular o quanto se deve adicionar de insertos. O jeito é ir tentando diferentes quantidades. Outra questão é que quanto menor o fragmento, mais eficientemente ele será clonado! Uma grande pedra no sapato quando se quer construir bibliotecas full lenght com fragmentos maiores que 1 kb. Por isso, é importante adicionar algumas etapas para remover do cDNA os fragmentos de menor tamanho, como já discuti aqui antes. Aliás, tudo favorece os fragmentos pequenos: PCR, ligação por T4 DNA ligase e a transformação de fragmentos pequenos são sempre mais eficientes e podem introduzir bias e reduzir a freqüência de fragmentos maiores.

Quando clonando apenas um gene específico, obtendo-se 20% de recombinantes, já é o suficiente: pegando 10 colônias, em pelo menos duas, você encontrará o seu clone! Mas, em uma biblioteca de qualidade, espera-se pelo menos 90% de clones recombinantes. Caso contrário, não vale a pena prosseguir com um “random sequencing”, ou seja, pegar 1000 clones, extrair o plasmídio e seqüenciar para achar apenas 200 sequencias que ainda por cima podem ser repetidas...é jogar dinheiro fora! Por isso, todo este sistema deve ser otimizado para estar funcionando muitíssimo bem: as enzimas de restrição, as etapas de purificação, a remoção de fragmentos pequenos, reação de ligação e transformação! Aliás, me convenci de vez: bibliotecas só transformando por eletroporação! Tentei transformar por choque térmico usando células “super”competentes comerciais, especiais para bibliotecas e para fragmentos grandes, etc...o controle, pUC18, plasmidio pequenininho, funcionou super bem, na ordem de 10(9), mas para as bibliotecas, não. O máximo que consegui foi na ordem de 10(4). Com a eletroporação, consegui um aumento de duas ordens de grandeza 10(6), sendo que não usei toda a minha reação de ligação.

Bom, isso tudo não é o fim do mundo, não é impossível – eu tenho 1 bilhão de papers no meu computador - só é mais difícil...mas a gente chega lá! :-)

Bom, mesmo eu tendo tratado o assunto clonagem meio superficialmente, ficou muitíssimo longo e chato, praticamente, um desabafo! Se você chegou até aqui ou é muito meu amigo ou provavelmente tem um interesse maior no assunto e recomendo a leitura deste capítulo de livro:

“Recombinant DNA technology and molecular cloning”
Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison
Outros dois capitulos deste livro estao disponiveis no link:
http://www.blackwellpublishing.com/allison/contents.htm

Apesar de ser um pouco básico é bem completo (e longo!).

7 comentários:

Yanomany T. disse...

Juliana, você poderia me dá o nome do livro e autor do qual você indicou o capítulo?
Gostei do seu desabafo sobre clonagem...
Ah, melhor... Se você tiver todo o livro em pdf poderia me enviar ou dizer onde posso encontra-ló?
Obrigada!

Yanomany T. disse...

esqueci...
meu e-mail para mais contatos:
ma.muet@hotmail.com

Juliana Americo disse...
Este comentário foi removido pelo autor.
Juliana Americo disse...

Ola, Yanomany,
Atualizei o post com o nome e a autora do livro e o link da homepage do livro, onde estao disponiveis outros 2 capitulos para download. O Livro inteiro,infelizmente, eu nao tenho...
Obrigada pela visita!

Yanomany T. disse...

Gostei do seu blog!
:D

Polyana K.M. disse...

Parabéns Juliana. Gostei muito do seu blog e das dicas de biomol! Amanhã mesmo coloco algumas em prática. Faço pós-doc com construção de cassetes para transformação genetica de plantas. Estava procurando alternativas para a clonagem convencional, como por recombinação, e achei seu blog. Bacana iniciativa de trocarmos experiencia de lab... Valeu! Polyana

Juliana Americo disse...

Oi Polyana,
Obrigada pelo comentário! :-)
Espero que as "dicas" funcionem, depois conte aqui no blog.
Abraços,
Juliana