19 de novembro de 2008

Vivendo (lendo) e aprendendo

Hoje eu li duas coisas, digamos, interessantes, que podem explicar nossos resultados com a ultima biblioteca.


1. Parece que o plasmidio da clontech que, supostamente, é fornecido digerido e fosforilado e pronto para clonagem nao é tao fosforilado assim. Eu nunca me senti confortàvel com isso. Sempre achei que se deve ter um estoque de plasmidio circular (para amplificar mais quando necessario) e EU MESMA digeri-lo e desfosforilà-lo para logo em seguida realizar a reaçao de ligaçao e assim evitar que o plasmidio circularize (sem inserto) antes ou durante a clonagem.

2. Durante o screening inicial da biblioteca, por meio de PCR de colonias, quando nao hà inserto no plasmidio, sao geradas bandas de aproximadamente 500 pb, especificamente com os primers e plasmidio que usei. Advinha qual era o tamanho da banda da maior parte dos clones que eu analisei??? Sim, isso mesmo! Aproximadamente 500 pb!
Mas, tudo bem. Este é o melhor momento para eu descobrir estas coisas. E viva as pessoas que publicam suas experiencias na internet, pois obviamente nenhuma destas informaçoes estava no manual do kit!
Obs: desculpem os erros, teclado italiano.

18 de novembro de 2008

RNA quality, again...

Durante este período fora, não vou abandonar o blog, mas usá-lo principalmente para ir contando como andam os experimentos aqui na Itália e o que mais eu for aprendendo de interessante...

Bom, ainda não comecei os experimentos, pois devo esperar as amostras e além disso determinar realmente o que vamos fazer e de quais reagentes iremos precisar. Assim que estiver com minhas amostras de RNA (total e poli-A) em mãos a primeira coisa que devo fazer é precipitá-las e checar a qualidade delas novamente. Isso inclui tudo aquilo que já discuti aqui e mais uma coisa que o Francesco me disse ser fundamental que é checar o tamanho da banda de rRNA 18S, pois se estiver muito abaixo do esperado é sinal de degradação (mesmo sem rastro) e todos os géis que eu fiz até então foram sem padrão :/. O ideal é usar um padrão de RNA, mas na falta de um, pode-se usar um de DNA também, para se ter ao menos uma idéia, pois o padrão de migração é um pouco diferente.
Parece que não é apenas eu quem tem problemas para extrair RNA de músculo de moluscos. É comum a razão 260/230 ficar baixa devido a contaminantes (principalmente, polissacarídeos). Aqui eles costumam extrair RNA do tecido congelado, ao invés de em RNA later, o que reduz o problema e é mais eficaz para inativar RNAses e, além disso, costumam fazer uma precipitação com cloreto de Lítio. Já tinha pensado em fazer as duas coisas no Brasil, mas não saiu do papel, pois foi pouco antes de vir para cá. Parece que a precipitação com cloreto de lítio é mágica, remove todos os contaminantes e não se perde nada da amostra. E o protocolo é bem simples. Vamos ver. Eu devo fazer com algumas das minhas amostras de músculo, pelo menos. A verdade dura e crua é que um RNA perfeito é essencial, principalmente, quando se quer construir uma biblioteca de cDNA, um processo longo e caro cujo resultado final pode ser totalmente comprometido pela qualidade do RNA utilizado. Então, o melhor é ser conservador ao extremo em relação as amostras de RNA.

Outra coisa interessante que o Francesco falou é que após a reação de clonagem e antes da transformação, devemos checar a resistência das bactérias ao antibiótico utilizado, pois se a linhagem exibir alguma resistência intrínsica, a seleção dos clones transformantes não vai ser eficiente. Pode ter sido o que aconteceu com a biblioteca que construímos ano passado, pois o número de colônias foi bem grande.

That's all for now.
Ciao ciao!