6 de agosto de 2008

Primer design

Desenhar um par de primers é bem simples, certo? É só desenhar oligonucleotídeos homólogos às regiões que flanqueiam a sua seqüência alvo. Na verdade, não é tão simples assim, ao menos se você realmente quer que seu PCR funcione. E que funcione bem: com uma eficiência alta e sem bandas não específicas. Além disso, depende muito de o que você quer amplificar (DNA genômico, um gene clonado em um vetor, cDNA?). A primeira vez em que eu desenhei um par de primers na minha vida, foi bem simples, eu fiz literalmente à mão. Peguei a seqüência ao alvo (um gene já seqüenciado e isolado em um vetor plasmidial) e desenhei um oligo para anelar no início e outro para anelar no fim do gene e adicionei um sítio de restrição a cauda 5’ de cada um dos primers, para posterior clonagem do amplicom em um vetor diferente. Depois chequei num programa de computador (oligocalculator) o conteúdo de GC e o Tm, para saber se eram compatíveis. E os primers funcionaram muito bem, obrigado! Mas hoje, eu acho que dei um pouco de sorte, pois eu não chequei várias coisas nestes primers que poderiam ter condenado o PCR a um desastre!




Agora, estou eu novamente desenhando primers, mas desta vez, usando um programa para isso, o primer3. Mas o contexto é bem diferente: tenho apenas o começo da seqüência alvo, logo, para os primers reverse e internos (nested), preciso lançar mão de um alinhamento de seqüências conhecidas para o mesmo gene de interesse em outras espécies, sendo que queremos amplificar o cDNA, mas nos bancos de dados há apenas seqüências genômicas disponíveis (sem os íntrons anotados, é claro, para facilitar).


Bom, mas quando eu já tinha feito quase todos os primers que eu queria com o primer3, comecei a ficar preocupada se este programa realmente fornecia oligos que não formem estruturas secundárias (grampos) e que não formassem dímeros. Procurei na Internet um programa que verificasse isso, especificamente, só para garantir, e achei o Netprimer, que verifica o potencial do primer em forma grampos (hairpin), dímeros, dímeros cruzados, seqüências palindrômicas, repetições e “runs” de um nucleotídeo (pelo menos 3 nucleotídeos iguais repetidos). Todas estas coisas podem diminuir em muito a eficiência do PCR: um primer que forma um grampo, não vai hibridizar na seqüência alvo (ou com uma eficiência muito baixa), se os primers formam dímeros, competem com a seqüência alvo, ou seja, a quantidade de primer realmente disponível para hibridizar na seqüência alvo, diminui drasticamente, etc. E qual foi a minha surpresa quando submeti as seqüências dos meus primers neste programa? De 4 primers, apenas 1 sobreviveu! Sendo que para cada um destes primers, o primer3 ainda me deu outros 4 oligos alternativos, mas todos eles também tinham algum problema! Ou seja, 15 primers diferentes e TODOS eles tinham algum (ás vezes, mais de um) destes problemas, como nas figuras abaixo, onde a primeira mostra a formação de um grampo e a segunda, de um dímero.




Além destas estruturas, ao se desenhar os primers, deve-se ter outras preocupações:

- Evitar “runs” de 3 ou mais G ou C na terminação 3’, pois pode diminuir a especificidade, uma vez que isso aumenta a estabilidade de hibridizações não específicas e a região 3’ é crítica para a especificidade e sensibilidade do PCR.
- Evitar um nucleotídeo T na terminação 3’.
- Evitar complementaridade entre os primers (para evitar a formação de dímeros).

Há muito mais sobre primers, mas como eu ainda não resolvi os problemas dos meus próprios, não vai dar para me estender além disso por aqui agora...